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Mah io ci vado a intuito ma non ho prove
La mia domanda non era per farti produrre necessariamente delle prove a sostegno di una specifica tesi, ma evidenziare quanto è inutile anche solo valutare di avviare questo tipo di indagine.

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la differenza è tra avere un dato in memoria (la variabile application) e doverselo andare a leggere da un file di testo con una chiamata...
In teoria...
Fermo restando che, per finire in Application, prima o poi il file va letto comunque.

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dovrebbe essere più rapido il primo metodo anche se il file web.config è tutto particolare visto che viene caricato prima di tutto
Esatto. E non solo: se configuri la "Dependency Injection", quei valori puoi tenerli in memoria comunque e recuperarli alla bisogna, senza scomodare Application, che è un oggetto che fa riferimento a un preciso contesto applicativo (il running dell'applicazione Web ASP.NET).

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per contro si occpupa memoria sul server (ma se hai solo quella variabile parliamo di occupazione praticamente nulla).
Esattamente.

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Alla fine penso sia irrilevante anch'io ma se dovessimo andare a contare i millesimi di secondo punterei sulla application.
Intanto, l'ordine sarebbe inferiore ai millesimi di secondo, e in secondo luogo - come peraltro hai già anticipato tu - ci sono altre questioni da prendere in considerazione, dove tu stesso hai scritto che l'effetto è nullo o non misurabile.

Se dovessi contare i secondi, direi che quelli persi ad analizzare una simile questione sono quelli più significativi.