Il codice va bene, l'oggetto $.Valori è non è ben definito sintatticamente.
Questo codice, ad esempio, funzione come dici tu:

Codice PHP:
<html>
    <script>
        var $ = {};
        $.Valori = {
            primo:{
            'a':'lettera A',
            'b': 'lettera B',
            'c':'lettera C'
            },
            secondo:{
            a:    [ '1a', '1b','1c' ],
            b:    [ '2a', '2b','2c' ],
            c:    [ '3a', '3b','3c' ]
            }
        };

        var lettere = ["a","b","c"];
        
        for (var i in lettere) {
            var let= $.Valori.secondo[lettere[i]]
            alert ( let[0]);
        }
    </script>
    
    <body>
    
    </body>
</html> 
Io personalmente avrei fatto così il ciclo, mi pare un pò più chiaro:

Codice PHP:
for(var i = 0, len = lettere.length; i < len; i++) {
    var let= $.Valori.secondo[lettere[i]]
    alert ( let[0]);
} 

In javascript puoi vedere un oggetto come un array associativo e possono essere creati "dal nulla" con la notazione JSON {x_1 : valore_1 [, x_i : valore_i]} dove i vari x_i sono degli identificativi e i valore_i sono oggetti (interi, float, object, array...).
Inoltre nota che gli array sono object dove, se usati come array, le chiavi sono degli interi (per questo il tuo ciclo for-in funziona).