Il colore di sfondo di una PictureBox con una immagine trasparente in effetti tende a diventare quello del suo contenitore (cioè il Form)

Prova a fare così:

1) L' immagine "sottostante" non metterla in una PictureBox ma come immagine di sfondo di un Panel
2) Inserisci NEL Panel l' altra PictureBox
3) Forza il colore di sfondo della PictureBox: PictureBox2.BackColor = Color.Transparent

A me funge... sappimi dire...