Prova a salvarti l'indice del l'elemento selezionato: quando selezioni un nuovo item deselezioni quello precedentemente selezionato.

codice:
Private Sub lst_ItemClick(ByVal Item As MSComctlLib.ListItem)
Dim vecchioSelezionato As Integer
lst.ListItems.Item(vecchioSelezionato).Checked = False
lst.SelectedItem.Checked = True
vecchioSelezonato = lst.SelectedItem.Index
End Sub