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In piccole dosi, la nicotina ha un effetto stimolante; aumenta l'attività, l'attenzione e la memoria. I consumatori abituali riportano anche un piacevole effetto rilassante. Aumenta inoltre il battito cardiaco, la pressione sanguigna e riduce l'appetito. In dosi elevate provoca nausea e vomito. La dose letale DL50 è 50 mg/kg per il ratto e 3 mg/kg per il topo.

I consumatori abituali di nicotina sviluppano una dipendenza fisica dalla sostanza. I sintomi dell'astinenza comprendono irritabilità, mal di testa e ansia. Possono durare mesi o anni, benché il loro picco venga raggiunto in genere tra le 48 e le 72 ore.

Benché la quantità di nicotina inalata tramite il fumo di tabacco sia piuttosto piccola (la maggior parte della sostanza è distrutta dal calore) è comunque sufficiente a creare dipendenza. La quantità effettivamente assorbita dal corpo dipende inoltre da altri fattori, quali il tipo di tabacco, l'effettiva inalazione, la presenza di un filtro.

Non appena la nicotina entra in corpo, questa viene rapidamente diffusa dalla circolazione sanguigna, tramite la quale arriva al sistema nervoso, data la sua capacità di attraversare la barriera ematoencefalica. In genere, giunge al cervello in circa sette secondi , dove agisce sui recettori dell'acetilcolina. A basse concentrazioni aumenta l'attività di questi recettori portando ad un aumento della produzione di adrenalina, un ormone stimolante. La cotinina è un prodotto del metabolismo della nicotina che permane nel sangue fino a 48 ore, può essere per questo usato come indicatore dell'esposizione individuale al fumo.
A concentrazioni elevate la nicotina blocca il recettore dell'acetilcolina, questa è la ragione della sua tossicità e della sua efficacia come insetticida.
Oltre a ciò, la nicotina aumenta il livello di dopamina nei circuiti celebrali del piacere. Studi hanno dimostrato che il fumo di tabacco inibisce la monoammina ossidasi (MAO), responsabile della degradazione nel cervello dei neurotrasmettitori monoamminergici, tra cui la dopamina. Questo genera una sensazione di piacere con un meccanismo analogo a quello innescato dalla cocaina ed all'eroina. Il vizio del fumo è quindi anche legato al mantenere elevati livelli di dopamina. È altresì possibile che altre sostanze presenti nel fumo di tabacco concorrano sinergicamente a creare questo effetto.